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定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系中培养神经元细胞的基础培养基

定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系中培养神经元细胞的基础培养基

  • 专利类型:发明专利
  • 有效期:2022-09-28至2024-09-28
  • 发布日期:2022-09-28
  • 技术成熟度:详情咨询
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  • 申请号 CN202010750543.0 
  • 公开号 CN-111793607-B 
  • 申请日 20170728 
  • 公开日 20220517 
  • 申请人 杨涛  
  • 优先权日期  
  • 发明人 杨涛  
  • 主分类号
  • 申请人地址 200020 上海市黄浦区重庆南路225号 
  • 分类号 C12N5/10 
  • 专利代理机构 北京鹏帆慧博知识产权代理有限公司 
  • 当前专利状态 授权 
  • 代理人 袁冰 
  • 有效性 有效 
  • 法律状态 授权
  •  
  • 01

    项目简介

    本发明公开了一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系中培养神经元细胞的基础培养基。本发明方法包括分阶段培养所述hiPSC诱导其神经分化,所述阶段包括:阶段a.共培养所述hiPSC与骨髓基质细胞HS5于诱导培养基;阶段b.用HS5条件培养基连续培养所述hiPSC;阶段c.用培养神经元细胞的基础培养基继续培养所述hiPSC。本发明的方法诱导人类hiPSC细胞定向分化为神经系统细胞,同时抑制非神经系统细胞的生成,从而获得成熟、广谱的神经细胞群。该神经细胞群不仅经过体外验证为具有电冲动发放的成熟神经元,而且这类神经细胞群在小鼠体内实验中也被证实,具有有效的治疗神经系统疾病(如脑卒中、脑损伤)的作用。

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  • 02

    说明书

    技术领域

    本发明属于神经生物学领域,具体涉及定向诱导hiPSC分化后的神经细胞体系、诱导方法及应用。

    背景技术

    人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSC)来源的神经细胞对于细胞移植治疗缺血性脑卒中(以多种不同种系的神经细胞严重缺失为特点)具有显著效应。然而,现有的诱导hiPSC细胞分化为神经细胞的操作效率低,稳定性差。

    干细胞生物学的最新研究进展为再生医学提供了依据,其中hiPSC细胞的定向分化可以为细胞移植治疗缺血性脑卒中(以各种神经元和神经胶质细胞的严重缺损为特性)患者提供了多种人类神经细胞。有效地诱导、纯化和植入人类神经细胞是建立以hiPSC细胞为基础的神经细胞疗法所必需的。许多有关高效分化神经细胞的方法草案已被提出。然而,这些方法不足以提供成熟的神经细胞谱系,致使幼稚细胞混杂于其中,导致脑内移植后畸胎瘤的形成。此外,某些方法只能分化产生一个窄谱的神经细胞系,不能满足治疗缺血性脑卒中所需的多种细胞类型。更重要的是,为将hiPSC细胞诱导的神经细胞应用于临床,诱导而来的神经系统细胞的分离纯化,以剔除非神经系统细胞及幼稚细胞是非常必要的。因此,建立基于hiPSC细胞的神经诱导和纯化系统已被人们期待已久(Rov,N.S.;Cleren,C.;Singh,S.K.;Yang,L.;Beal,M.F.;Goldman,S.A.Functional engraftment of human EScell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes.Nat.Med.12:1259–1268;2006;Yan,Y.P.;Yang,D.L.;Zarnowska,E.D.;Du,Z.W.;Werbel,B.;Valliere,C.;Pearce,R.A.;Thomson,J.A.;Zhang,S.C.Directed differentiation of dopaminergic neuronal subtypes fromhuman embryonic stem cells.Stem Cells 23:781–790;2005;Gerrard,L.;Rodgers,L.;Cui,W.Differentiation of human embryonic stem cells to neural lineages inadherent culture by blocking bone morphogenetic protein signaling.StemCells23:1234–1241;2005;Keirstead,H.S.;Nistor,G.;Bernal,G.;Totoiu,M.;Cloutier,F.;Sharp,K.;Steward,O.Human embryonic stem cell-derived oligodendrocyteprogenitor cell transplants remyelinate and restore locomotion after spinalcord injury.J.Neurosci.25:4694–4705;2005.)。

    发明内容

    本发明所要解决的技术问题是为了克服目前现有技术提供的神经细胞谱系不成熟,致使幼稚细胞混杂于其中导致脑内移植后畸胎瘤形成的不足,提供一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的方法、制得的神经细胞体系及其应用。本发明的方法诱导人类hiPSC细胞定向分化为神经系统细胞,同时抑制非神经系统细胞的生成,从而获得成熟、广谱的神经细胞群。该神经细胞群不仅经过体外验证为具有电冲动发放的成熟神经元,而且这类神经细胞群在小鼠体内实验中也被证实,具有有效的治疗神经系统疾病(如脑卒中、脑损伤)的作用。

    本发明解决上述问题的技术方案之一是:一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的方法,其包括分阶段培养所述hiPSC诱导其神经分化,所述阶段包括:

    阶段a.共培养所述hiPSC与骨髓基质细胞HS5于诱导培养基;

    阶段b.用HS5条件培养基、即含有所述HS5的分泌液的诱导培养基连续培养所述hiPSC;

    阶段c.用培养神经元细胞的基础培养基继续培养所述hiPSC。

    其中,阶段a中所述的所述诱导培养基为本领域常规的诱导培养基;较佳地,所述诱导培养基包括下述组分:20-25%血清替代品、0.5-1.5mM的谷氨酰胺、8-20ng/ml表皮生长因子、8-12ng/ml脑源性神经营养因子、8-15ng/ml神经营养因子-3、0.5-1.5ng/ml转化生长因子β3、400~700ng/ml头蛋白以及2-3%B27添加剂的DMEM/F12培养基,所述百分比为体积百分比。更佳地,为了在干细胞向神经细胞谱系分化的过程中有效地同步促进细胞分化产物的增殖活性,所述诱导培养基还包括1-1.5%非必需氨基酸、8-15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、0.08-0.15mMβ-巯基乙醇以及0.3-0.8mM双丁酰环磷酸腺苷。

    阶段a中所述的共培养可以为直接接触共培养或者非直接接触共培养,较佳地为直接接触共培养。

    阶段a中所述的骨髓基质细胞HS5为抑制分裂的HS5;较佳地,所述抑制分裂的方法为照射;更佳地,所述照射的条件为:γ射线辐照强度75-85Gy,照射时间为28-35分钟,所述的辐照强度优选为80Gy,所述的照射时间优选为30分钟。

    阶段a中所述的共培养的时间为本领域常规,较佳地为10-18天,更佳地为2周。

    阶段b中所述的连续培养的时间为本领域常规,较佳地为8-18天,更佳地为2周。

    阶段c中所述的继续培养的时间为本领域常规,较佳地为10-18天,更佳地为2周。

    阶段c中所述的基础培养基为添加有:15-30ng/ml bFGF、15-30ng/ml EGF、1-3%B27添加剂、8-12μM佛司可林和0.1-0.3mM抗坏血酸的neurobasal培养基;较佳地,为了有效地维系处于分化终末阶段的成熟神经元的存活率,所述基础培养基还包括0.5-1.5%N2添加剂和0.5-1.5%胎牛血清;更佳地,阶段c所述的基础培养基为添加有:20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、2%B27添加剂、1%N2添加剂、1%胎牛血清、10μM佛司可林和0.2mM抗坏血酸的neurobasal培养基,所述百分比为体积百分比。

    本发明解决上述问题的技术方案之二是:一种上述方法诱导得到的神经细胞体系。较佳地,所述神经细胞体系包括:神经干细胞59.3±1.9%、多种功能性神经元28.2±2.1%、星形胶质细胞9.1±0.8%以及少突胶质细胞4.8±0.6%,所述百分比为占整个神经细胞体系的个数百分比。其中,所述的多功能性神经元细胞包括:多巴胺能神经元5.4±0.4%、乙酰胆碱能神经元9.3±0.6%、γ-氨基丁酸能神经元3.9±0.3%、5-羟色胺能神经元6.5±0.5%以及幼稚神经元3.1±0.4%;所述百分比为占整个神经细胞体系的个数百分比。

    本发明解决上述问题的技术方案之三是:一种上述的神经细胞体系在制备脑组织细胞修复制剂中的应用;较佳地,所述制剂为治疗缺血性脑卒中、脑出血或者外伤导致的脑损伤的制剂。

    本发明解决上述问题的技术方案之四是:一种初步诱导hiPSC分化为神经细胞体系的诱导培养基,所述培养基为包括下述组分:20-25%血清替代品、0.5-1.5mM的谷氨酰胺、8-20ng/ml表皮生长因子、8-12ng/ml脑源性神经营养因子、8-15ng/ml神经营养因子-3、0.5-1.5ng/ml转化生长因子β3、400~700ng/ml头蛋白以及2-3%B27添加剂的DMEM/F12培养基,所述百分比为体积百分比;较佳地,所述培养基还包括1-1.5%非必需氨基酸、0.08-0.15mMβ-巯基乙醇、8-15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子以及0.3-0.8mM双丁酰环磷酸腺苷。若上述培养基组分的含量低于上述数值范围的下限,则hiPSC在分化过程中的存活率很低(分化产物的总存活率低于40%);若高于上述数值范围的上限,则hiPSC的分化产物不但存活率低(低于45%),而且hiPSC向神经谱系细胞的分化效率亦显著降低(低于24%)。

    本发明解决上述问题的技术方案之五是:一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基,其为含有骨髓基质细胞HS5的分泌液的诱导培养基;所述HS5为经过照射的HS5;所述照射的条件为:γ射线辐照强度75-85Gy,照射时间为28-35分钟,所述辐照强度优选为80Gy,所述照射时间优选为30分钟;

    本发明解决上述问题的技术方案之六是:一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系中培养神经元细胞的基础培养基,所述的基础培养基为包括:15-30ng/ml bFGF、15-30ng/ml EGF、1-3%B27添加剂、8-12μM佛司可林和0.1-0.3mM抗坏血酸的neurobasal培养基。若上述培养基组分的含量低于上述数值范围的下限,则可致hiPSC分化而来的成熟神经元的存活率较低(会低于60%);若高于上述数值范围的上限,则可引发成熟神经元发生凋亡而致使其存活率低(可低于50%)。

    较佳地,所述基础培养基还包括0.5-1.5%N2添加剂和0.5-1.5%胎牛血清。更佳地,所述的基础培养基为包括20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、2%B27添加剂、1%N2添加剂、1%胎牛血清、10μM佛司可林和0.2mM抗坏血酸的neurobasal培养基,所述百分比为体积百分比。

    在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。

    本发明所用试剂和原料均市售可得。

    本发明的积极进步效果在于:

    本发明将骨髓基质细胞(human bone marrow stromal cells,BMSC)HS5以及hiPSC共培养,可以诱导人类hiPSC细胞定向分化为神经系统细胞,同时抑制非神经系统细胞的生成,从而获得成熟、广谱的神经细胞群。该神经细胞群不仅经过体外验证为具有电冲动发放的成熟神经元,而且这类神经细胞群在小鼠体内实验中也被证实,具有有效的治疗神经系统疾病(如脑卒中、脑损伤)的作用。利用该发明中所使用的阶梯式培养方法以及一系列添加物,可以形成规范化、商业化的体外培养流程,从而迎合国内和国际上对于“iPS诱导与移植疗法”的临床与科研需求。

    附图说明null实施方式

    下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。

    字母缩写:

    hiPSC:Human Induced Pluripotent Stem Cell人类诱导多潜能干细胞

    MEF:mouse embryonic fibroblasts小鼠胚胎成纤维细胞

    KSR:knockout serum replacement血清替代物

    bFGF:basic fibroblast growth factor碱性成纤维细胞生长因子

    EGF:epidermal growth factor表皮生长因子

    NEAA:non-essential amino acids非必需氨基酸

    BDNF:brain-derived neurotrophic factor脑源性神经营养因子

    NT-3:neurotrophin-3神经营养因子-3

    GFAP:glial fibrillary acidic protein胶质原纤维酸性蛋白

    MAP-2:microtubule-associated protein 2微管相关蛋白2

    Nurr-1:nuclear receptor related protein-1核受体相关蛋白1

    Oct-4:octamer binding transcription factor 4八聚体结合转录因子4

    ALP:alkaline phosphatase碱性磷酸酶

    另,本发明中未特别说明的百分比(%)一般为体积百分比。

    实验方法:

    1、表达载体的构建

    2、逆转录PCR

    逆转录后获得的cDNA第一条链进行特定基因序列的扩增。用SYBR Green法进行荧光定量PCR扩增反应(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)。应用比较CT法,对照组与实验组呈现出显著的倍数差异,具体如图2所示。

    3、电生理分析

    室温下,用Axopatch-200B放大器(Axon Instruments Inc.,Foster City,CA,USA)进行细胞电压记录。膜片钳附带的吸管内含有120mM的葡萄糖酸钾,20mM KCl,10mMNaCl,10mM EGTA,1mM CaCl2,2mM Mg-ATP,0.3mM Na-GTP以及10mM HEPES/KOH(pH 7.2,280mOsmol/kg),带有约3–5Ω的电阻。在记录膜电位之前确保电流为0pA。

    4、多巴胺释放试验

    5、免疫印迹分析

    总蛋白(20μg)经12%SDS-PAGE电泳、转膜后(Millipore,Billerica,MA,USA)滴加抗体。一抗分别是,兔抗NICD(1:1000;Cell Signaling Technology,Beverly,MA,USA),兔抗Hes1(Hes1;1:500;Chemicon,Temecula,CA,USA),兔抗Hes5(1:500;Chemicon)和鼠抗α-tubulin抗体(1:2000;Chemicon)。二抗是HRP(辣根过氧化物酶)标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG或IgM(1:2000;Millipore),利用图象软件量化条带强度(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)。

    6、脑手术

    动物实验符合美国国立卫生研究院的相关规定,并获得地方政府批准。成年雄性蒙古沙鼠(年龄12-13周,体重60–80克)经2%氟烷麻醉后暴露双侧颈总动脉,用动脉瘤夹闭塞5分钟后释放(Ridenour TR et al.Brain Res.1991;565(1):116-122)。对照组沙鼠施行无双侧动脉闭塞的假手术操作。

    7、细胞移植

    8、行为分析

    Morris水迷宫实验(Harvard Apparatus,Holliston,MA,USA)用来评估模型动物的空间认知能力。移植术后六周,对动物进行为期13天的训练,每天4次,在第14天进行正式的行为评估,同时进行空间探索实验。简而言之,在第14天,拆除水面下预设的动物休息平台,让动物在水迷宫中停留60秒。记录60秒内沙鼠穿越原平台位置的次数,同时记录沙鼠滞留于原平台所在的象限区域内的时间。

    9、酶免疫测定

    从离体脑组织中分离海马,加入缓冲液(20mM Tris-HCl,137mM NaCl,1mM DTT,0.5%Triton X-100and 0.5mM PMSF;pH 8.0)进行匀浆,4℃,14,000g离心30分钟。按照说明使用检测试剂盒(Quantikine HS;R&D Systems)对碱性成纤维细胞生长因子进行定量测定。

    10、组织学分析

    离体脑组织沿冠状面作厚5μm的冰冻切片。在连续切片过程中以每第五张切片内的免疫反应阳性的细胞数计量供体细胞的数量,最后经Abercrombie formula公式校正。另外,前囟与后囟之间约2-2.2mm的组织经连续切片后以0.2%硫素染色后拍照,显微镜下每帧图像以1mm×0.25mm维度的标尺框架进行测量、计数。海马CA1区中完整锥体神经元(细胞核大,核仁明显和细胞膜清晰)按照先前描述的方法进行计数。依据之前描述的标准对海马CA1区的细胞进行分级:0级,固缩的CA1锥体神经元占比<框架内细胞总数的10%;I级,固缩CA1锥体神经元占框架内细胞总数10%–40%;Ⅱ级,固缩细胞占40%–70%;Ⅲ级:固缩细胞占比≥70%。

    11、免疫细胞化学

    12、统计分析

    数据均用平均值±标准误表示。SNK检验和t检验进行两两比较分析,Nemenyi检验进行海马锥体细胞层的组织学分级分析。应用SPSS17软件系统(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA),P值<0.05被认为有统计学意义。

    实施例1骨髓基质细胞系HS5与hiPSC细胞共培养体系的建立

    实施例2 hiPSC细胞神经分化的三阶段培养

    实施例3直接接触共培养激活hiPSC细胞中的Notch信号通路

    鉴于Notch配体Delta1、delta3、Jagged1和Jagged2均可利用实验方法中“逆转录PCR”的方法轻易在HS5细胞中检测到(图2a),而在hiPSC细胞及其衍生物中又可以检测到Notch相应受体Notch1、Notch2和Notch3(图2b),推测Notch信号通路是HS5和hiPSC细胞相互作用的媒介。NICD蛋白经γ-分泌酶作用后,与Notch受体解离,且靶向作用于下游分子Hes1和Hes5。诱导分化8天后,利用实验方法中的“免疫印迹分析”方法检测各组hiPSC衍生细胞中NICD蛋白的表达水平。结果显示,直接接触共培养组显著高于非接触共培养组和对照组(图2c-d),表明直接接触共培养方法能够显著激活hiPSC细胞衍生物中的Notch信号通路。值得注意的是,非接触共培养同样可以提高NICD、Hes1、Hes5的表达水平,尽管程度非常小。这表明HS5可能分泌一种对Notch信号通路具有激活作用的可溶性分子。

    与对照组非直接接触共培养相比,直接接触共培养8天后,hiPSC衍生细胞中神经外胚层相关基因如Sox-1、Pax-6和NFH的表达水平明显增加,而内胚层,中胚层和干细胞相关基因表达降低(图2)。这些数据表明,HS5直接接触共培养可以促进hiPSC细胞向神经细胞分化并同时阻断其向非神经细胞方向分化。随后,本发明进一步测试Notch信号是否是HS5介导的神经诱导分化所必不可少的。添加Notch信号通路抑制剂L-685458连续培养8天后,检测发现NICD、Hes1、Hes5在HS5共培养细胞中的表达水平明显降低,其中NICD和Hes5减少后的水平与对照组使用L-685458的表达水平无明显差别(图2c-d),表明L-685458可以完全阻断Notch通路的激活和活化。但是L-685458对Hes1表达水平的影响较小(图2c-d),这进一步证实了Hes1的表达不仅仅依赖于Notch信号通路。此外,加入L-685458后,HS5直接接触共培养促进Sox-1,Pax-6和NFH表达的作用减弱,相反,非神经标记物的表达因脱抑制而增加(图2e),这表明Notch信号通路在HS5介导的hiPSC细胞神经诱导分化中起着举足轻重的作用。L-685458降低了实验组和对照组中Pax-6阳性细胞的表达率,但是对细胞活力无明显影响(图2f,g)。另一方面,与只转染载体(pcDNA3.1)的对照组相比较,转染有pcNICD(构建方法见实验方法)的iPS-1细胞,培养8天后,Pax-6阳性细胞明显增加(图2h),具有向神经细胞分化的倾向。这说明NICD,作为Notch信号通路的效应因子,可以推动hiPSC细胞向神经细胞分化。所有的数据表明,Notch信号的活化可能是,至少部分是,直接共培养方法促进hiPSC细胞向神经细胞谱系分化所必需的因素。

    实施例4 hiPSC细胞来源的神经细胞体系的组成鉴定

    HS5诱导培养后,Pax-6表达阳性的神经前体细胞在第二阶段的连续培养中迅速增加,甚至在培养末期阳性率达到87.2±1.9%,与此同时,SSEA-4阳性的未分化细胞数目逐渐减少直至到零(图3),RT-PCR反转录进行cDNA合成,反应条件为42℃50min,95℃5min,再置于4℃环境储存。然后利用PCR扩增cDNA中的目的基因。PCR基本反应条件为:(1)cDNA预变性:94℃5min;(2)PCR扩增:94℃30sec,60℃30sec,72℃45sec,进行30次循环;(3)最后延伸阶段:72℃7min。引物序列参见表1。

    表1用于反转录PCR的引物序列及目的基因长度

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